色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負著分離工作的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。目前市場上色譜柱種類和規(guī)格繁多，在制藥、食品、環(huán)保、石化、農(nóng)林、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域有應(yīng)用廣泛，相關(guān)從業(yè)人數(shù)不斷增長。

此次，我們一起來探討一下月旭色譜柱技術(shù)的特點及目前色譜柱技術(shù)總體發(fā)展中存在的壁壘。

 核殼結(jié)構(gòu)色譜填料+體積排阻色譜填料

作為中國的色譜柱品牌，月旭科技自2005年從事色譜相關(guān)業(yè)務(wù)至今已走過了14個年頭。期間，月旭科技在色譜領(lǐng)域始終堅持自主研發(fā)和自主品牌，先后推出了包括Ultimate®、Xtimate®、Welchrom®、Topsil®和Boltimate®等多個品牌的色譜柱及色譜填料產(chǎn)品，并為客戶提供色譜分離分析技術(shù)、產(chǎn)品和整體解決方案。由于堅持創(chuàng)新，月旭科技在色譜填料的研發(fā)和色譜分離分析方法開發(fā)方面已經(jīng)達到國內(nèi)外領(lǐng)xian水平。據(jù)介紹，目前月旭團隊開發(fā)的色譜填料超過百余種，在醫(yī)藥、食品和環(huán)境檢測方面的應(yīng)用超過5000個。其中有19款月旭色譜柱被列入美國USP-PQRI數(shù)據(jù)庫，2015版中國藥典中，有多個藥品品種*使用月旭色譜柱產(chǎn)品。依托技術(shù)優(yōu)勢，2018年月旭色譜柱年銷量取得了超過4萬根的好成績。以下是兩種月旭自主研發(fā)的國內(nèi)外領(lǐng)xian的色譜填料，一種是核殼結(jié)構(gòu)色譜填料，另一種則是體積排阻色譜填料。

核殼結(jié)構(gòu)色譜填料

該類填料初是由色譜科學(xué)家 Jack Kirkland 在2006年研制成功的一種新型色譜填料。它是將多孔硅殼熔融到實心的硅核表面而制備的。這些多孔的“光環(huán)”狀顆粒具有極窄的粒徑分布和擴散路徑，可以同時減小軸向和縱向擴散，允許使用更短的色譜柱和較高的流速以達到快速、高分辨率分離。

月旭科技研發(fā)的Boltimate®核殼色譜柱中硅膠顆粒粒徑是2.7μm，它是由1.7μm直徑的實心核與0.5μm厚的多孔層所構(gòu)成的。這種核殼型的硅膠顆粒提供了較短的傳質(zhì)路徑，減少了軸向擴散，而實心核硅膠提供堅固的支撐結(jié)構(gòu)，可以承受高壓，具有與1.8 μm 填料相似的分離效率，且柱反壓只有sub-2μm色譜柱的50%和明顯的抗污染性能。由于實心核的存在，以及薄的多孔層，使得樣品分子的擴散距離減小，即可以使用更高的流動相流速，極大的提高了分析速度。目前月旭已經(jīng)有Boltimate® C18、Boltimate® LP -C18、Boltimate® EXT C18、Boltimate® Phenyl-Hexyl、Boltimate® EXT PFP等多款該系列色譜柱。國外也有一些色譜柱廠家成功研發(fā)了該類型產(chǎn)品，例如AMT公司的HALO色譜柱、Sigma-Aldrich公司的Ascentis Express 核殼柱等。

核殼色譜柱填料結(jié)構(gòu)

體積排阻色譜填料

體積排阻色譜(Size exclusion chromatography，SEC)是一種*按照溶質(zhì)分子在流動相溶劑中的分子尺寸大小分離的色譜法，是非常重要的分離分析生物大分子如蛋白質(zhì)、多肽、生物酶的工具。其分離原理如下：該類填料具有一定孔徑分布，當(dāng)具有不同尺寸的目標(biāo)物分子進入體積排阻色譜柱時，分子量很大的分子無法進入填料內(nèi)部孔中，因此zui先被洗脫下來；分子量相對較小的分子能夠進入一部分填料內(nèi)部孔中，因此隨后被洗脫下來；分子量很小的分子則能夠進入到填料的所有內(nèi)部微孔中，因而其洗脫體積接近色譜柱的柱體積；根據(jù)洗脫體積的不同，可實現(xiàn)各組分之間的有效分離。體積排阻色譜填料通常是具有適合一定孔徑的球形硅膠基質(zhì)填料，由于它具有良好的機械強度及具有*的分離純化效率，在生物大分子的分離分析領(lǐng)域廣泛使用。

月旭研發(fā)的Xtimate® SEC填料是在超高純?nèi)嗫坠枘z表面包覆一層具有良好穩(wěn)定性的親水性聚合物的體積排阻色譜填料，該填料的作用基團為二醇基。這種填料表面因受二醇基官能團保護而不與蛋白質(zhì)相互作用。使得蛋白、生物酶、多肽等樣品的非特異性吸附極小，因而廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離。目前月旭已有120A、200A、 300A、500A、700A、1000A和2000A等幾種孔徑尺寸規(guī)格的SEC色譜柱產(chǎn)品。國內(nèi)外也有一些色譜柱廠家成功研發(fā)了該類型產(chǎn)品，例如TOSOH公司的TSK gel SW-型色譜填料、安捷倫公司的ZORBAX GF色譜填料等。

月旭科技色譜柱

No.2 色譜技術(shù)發(fā)展迅速，填料技術(shù)仍存壁壘

液相色譜（HPLC）是一項、新穎、快速的分析分離技術(shù)，是廣泛應(yīng)用的分析手段之一。隨著科技的進步，色譜得到了很大的發(fā)展，色譜技術(shù)性的研究在目前科研技術(shù)研究中一直占有重要定位，特別是一些相關(guān)檢測行業(yè)，應(yīng)用性研究顯得十分普遍。而色譜柱填料是各種HPLC分離模式賴以建立和發(fā)展的基礎(chǔ)，因此高性能填料成為色譜研究中豐富、有活力、富于創(chuàng)造性的部分，且各種專用色譜填料的出現(xiàn)，解決了很多分析檢測中的問題。不過由于色譜技術(shù)基礎(chǔ)性、原理性的研究發(fā)現(xiàn)還有局限，目前仍然有很多問題解決不了的。

強極性物質(zhì)的保留

在強極性物質(zhì)保留方面，HILIC模式的提出雖然使大家看到了一線希望，不過該模式的原理研究不夠透徹全面，使得在應(yīng)用的過程中，理論不能很好指導(dǎo)實踐，這就增加了方法摸索的難度。HILIC模式的優(yōu)勢在于多種色譜作用模式能分離開更多的物質(zhì)，且與反相和正相法有更多的正交性，但由于混合模式的多樣，使得次級吸附作用力的影響不能*避免，導(dǎo)致強極性物質(zhì)在HILIC模式下的峰形問題較大，同時色譜填料中與物質(zhì)的作用位點較多，使得填料的鍵合均勻度等引起的重現(xiàn)性問題顯得尤為明顯。

其次，反相條件下使用純水流動相也具有壁壘。現(xiàn)在“極性改性”技術(shù)的引進，使得非極性鍵合相的極性會有所增強，在極性環(huán)境（甚至是純水環(huán)境）下都會有很好的填料活性，而不會產(chǎn)生相塌陷，因此一些強極性物質(zhì)可以在此條件下有所保留。但是，純水流動相對于鍵合相的洗脫能力不夠，導(dǎo)致色譜柱易吸附同極性的物質(zhì)而被污染，改性填料導(dǎo)致結(jié)果不重現(xiàn)，同時也易引起填料污染導(dǎo)致的柱壓升高、峰形異常等現(xiàn)象而縮短色譜柱的壽命。

后，其他無機鍵合相對于強極性物質(zhì)保留的壁壘主要是基礎(chǔ)研究少、應(yīng)用范圍窄、價格昂貴、色譜柱維護使用不常見且對人員操作要求高。

離子化物質(zhì)的分析分離

在分析分離離子化物質(zhì)時，也有很多的局限性。比如反相填料+離子對試劑是現(xiàn)在普遍采用的色譜分析方式，但該方式基線平衡時間長，使用后色譜柱沖洗時間長，填料容易受殘留離子對試劑的影響而改性。如果用這樣的色譜柱進行方法開發(fā)，后期新色譜柱不能重現(xiàn)結(jié)果的風(fēng)險會大大增加，而且離子對試劑價格較貴，會增加分析成本。

離子交換法雖然專屬性強，是做單一物質(zhì)含量分離的良好選擇，但對于多組分分離，單一的色譜作用模式很難滿足多種性質(zhì)物質(zhì)的保留和分離，導(dǎo)致適用面較窄，而流動相通常使用高濃度的緩沖鹽，在儀器系統(tǒng)中易析出，不利于儀器的壽命，需要加強對儀器的沖洗維護。此外，鍵合相的官能團通常為小基團試劑，在高水、高鹽、低pH條件、高溫等條件下易水解，導(dǎo)致色譜柱壽命普遍短于反相大基團鍵合的填料。而HILIC法在分析離子化物質(zhì)時同樣有與在強極性物質(zhì)的保留方面相似的壁壘。

異構(gòu)體的分離

分離光學(xué)異構(gòu)體，特別是具有2個及2個以上的手性中心的異構(gòu)體時，難度會大大增加。目前市場上這一類物質(zhì)的分離主要用到各種手性鍵合相或者手性流動相添加劑，其中手性鍵合相是主流。但是鍵合相大都采用涂覆工藝，有嚴格的耐受溶劑和柱壓要求，否則會加快涂覆官能團的脫落，縮短壽命。由于對手性分離不夠全面，在選擇固定相和流動相時，理論指導(dǎo)不夠，更多是要依靠實踐，所以增加了分析成本，降低了成功率。此外，由于手性色譜法專屬性強，常規(guī)要求拆分的物質(zhì)的化學(xué)純度在95%以上，這樣會導(dǎo)致該方法在檢測制劑時由于輔料等的干擾而不能對成品進行質(zhì)控。

對于位置異構(gòu)體，由于物質(zhì)的極性、離子性等差異不大，目前較多的是選擇鹵代柱（PFP,F-C8）、高載碳量的C18（23%）柱、長碳量的反相（C22，C30）柱等利用其空間位阻效應(yīng)將其分離。但是如果位置異構(gòu)的基團較小，別的基團的空間位置效應(yīng)較強，屏蔽了該小基團位置差異帶來的空間差異，也將無法分離。此外，單雙鍵異構(gòu)對于現(xiàn)在的色譜技術(shù)同樣有很大的挑戰(zhàn)，目前暫時沒有有效手段能將其分離。